Publications

Thèses, HDR

Étude de la polymérisation des protéines phloèmiennes par utilisation de la microfluidique visant à mimer le flux de sève élaborée dans le phloème

Le transport de la sève élaborée chez les végétaux supérieurs s'effectue dans des files cellulaires très allongées, sous pression hydrostatique, les tubes criblés, qui assurent la redistribution des sucres issus de la photosynthèse. Ces cellules représentent un cas unique de spécialisation. Leur formation et l’acquisition de leur fonction s’accompagnent de l’apparition de composés protéiques typiques, les protéines P qui polymérisent en filaments caractéristiques. L'objectif de la thèse vise à élucider les relations structure-fonction des protéines P et en particulier les conditions de polymérisation en utilisant la microfluidique comme voie mimétique de circulation du flux de sève phloèmienne.

Caractérisation biochimique et structurale d’inhibiteurs des facteurs d’échange des petites protéines G Arf et Rho

La soutenance de thèse aura lieu à la bibliothèque du LEBS à 14 h (http://www.lebs.cnrs-gif.fr/)

Résumé

Les petites protéines G et les facteurs d’échange sont des cibles thérapeutiques potentielles dans de nombreuses pathologies. Leur inhibition reste un véritable défi du fait de la complexité biochimique et structurale de la réaction d’échange. C’est pourquoi il est critique d’identifier les « talons d’Achille » pour pouvoir ensuite guider la découverte de nouveaux inhibiteurs. Une étape importante est de caractériser le mécanisme des inhibiteurs actuellement connus et identifier, puis éventuellement manipuler, leur spécificité. A ce jour, six inhibiteurs des facteurs d’échange sont connus. Dans ce travail, je me suis intéressé à la caractérisation biochimique et structurale de quatre des six inhibiteurs actuellement connus. J’ai démontré, en combinant les données biochimiques et structurales disponibles et en utilisant des analogues de la BFA et des mutants d’Arf et de Sec7, que la BFA possède une double spécificité. Cette spécificité peut être cartographiée à un seul acide aminé sur le domaine Sec7, mais elle semble dépendre de paramètres dynamiques chez Arf. J’ai ensuite participé à la caractérisation de LM11, découvert par criblage in silico. J’ai montré que LM11 inhibe l’activation des Arf dans la cellule et j’ai identifié deux résidus du domaine Sec7 et un d’Arf qui permettent de moduler l’inhibition par le LM11. Les constructions d’Arf et de Sec7 établies pour ces deux études m’ont permis d’entreprendre une étude approfondie du mécanisme et de la spécificité in vitro de la SecinH3, un inhibiteur chimique découvert en 2007 par déplacement d’aptamères. De façon remarquable, ces trois inhibiteurs ont des mécanismes différents et des spectres de spécificité croisés mais distincts. Mes travaux ont également porté sur l’inhibition par un inhibiteur peptidique d’un autre couple petite protéine G/GEF, RhoA et Tgat, impliqués dans un processus de cancer. Ces travaux suggèrent qu’il devrait être possible, dans le futur, de cibler avec spécificité un couple de petite protéine G/GEF d’intérêt thérapeutique.

Caractérisation et analyse fonctionnelle de nouveaux gènes cibles du facteur de transcription hStaf/ZNF143

Le facteur de transcription Staf et son orthologue humain ZNF143 sont impliqués dans l’activation de la transcription de gènes d’ARN non codants transcrits par l’ARN polymérase II et III et dans celle de 7 gènes de protéines. L’objectif de ma thèse était de caractériser de nouveaux gènes cibles de ce facteur chez l’homme. Par une approche bioinformatique couplée à des expériences de ChIP, nous avons montré qu’environ 10% des promoteurs de gènes de protéines humaines fixent hStaf/ZNF143. Ceci suggère que le site de liaison de hStaf/ZNF143 (SBS) est l’un des plus abondants dans les génomes de mammifères. En parallèle, nous avons étudié les promoteurs des gènes TFAM, BUB1B et SCARNA2 dans lesquels nous avons identifié des éléments conservés dont des sites SBS. Nous avons montré l’importance de ces éléments dans la transcription. Ces résultats mettent en évidence que Staf régule l’activité de gènes impliqués dans des processus cellulaires divers via des promoteurs à architectures variées.

Cristallogenèse et études structurales appliquées aux aminoacyl-ARNt synthétases

La GlnRS de Deinococcus radiodurans se distingue des autres GlnRS par la présence d'un appendice additionnel en C-terminal (C-ter). Celui-ci adopterait le même repliement que la famille de protéines YqeY de fonction inconnue et une région de la sous-unité GatB de l'AdT. Son architecture atypique, trouvée dans 4 organismes, corresponds à la fusion de protéine de la voie directe et indirecte d'aminoacylation des ARNt. La structure cristallographique de la GlnRS-Dr nâ??a pas permis de résoudre la région C-ter, la maille étant suffisamment large pour lâ??accommoder. Des analyses en RMN du C-ter isolé ont confirmé la présence d'une région majoritairement structurée. D'autres structures ont été résolues en présence de petits substrats (glutamine, analogues dâ??adénylate) ainsi que la forme tronquée en C-ter. Dans 2 cas, une conformation verrouillée unique du site actif a été mise en évidence. Des analyses structurales et fonctionnelles et les propriétés de lâ??empilement cristallin sont exposées.

La tyrosyl-ANRt synthétase mitochondriale humaine : originalités fonctionnelles, structurales et place dans l'évolution.

Ma thèse porte sur l’étude fonctionnelle et structurale des partenaires de la réaction d'aminoacylation spécifique de la tyrosine dans la mitochondrie humaine. Contrairement à ce qui a été observé pour les autres systèmes d'aminoacylation, les réactions de charges croisées entre bactéries et archaea/eucaryotes sont impossibles suite à la nature différente de la première paire de bases de l'ARNtTyr. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) mitochondriale humaine est la première TyrRS connue à ce jour qui s'affranchisse de la barrière d'espèces et qui ne discrimine pas les ARNtTyr en fonction de la nature de leur première paire de bases. La TyrRS mitochondriale est un homodimère de forme allongée susceptible de fixer l'ARNtTyr à cheval sur ses deux monomères. Elle se distingue des autres TyrRS par la présence de deux insertions à sa surface, l'une potentiellement impliquée dans la reconnaissance de l'ARNtTyr et l'autre qui pourrait constituer une zone d'interaction avec un cofacteur.

Régulation de l'expression du récepteur de type II au TGFbeta par l'Interleukine-1beta. Rôle dans l'arthrose.

L’homéostasie du cartilage est contrôlée par un réseau de cytokines, telles que l’IL-1ß et le TGFß. Ces cytokines qui induisent des effets antagonistes, jouent un rôle clé dans le processus arthrosique. Le but de ce travail était de déterminer l’influence de l’IL-1ß sur l’expression du TßRII et sur la réponse au TGFß des chondrocytes articulaires humains.
Nous avons montré que l’IL-1ß limite le signal TGFß en diminuant l’expression du TßRII et secondairement en augmentant celle de Smad7. Cet effet sur le TßRII est dû à la réduction de son activité transcriptionnelle et à l’augmentation de sa dégradation. De plus, nous avons démontré que cette diminution du TßRII requiert une néosynthèse protéique et implique les voies de signalisation NFkB et JNK. Nous avons aussi établi que l’IL-1ß réprime la transcription du TßRII via le promoteur minimal et plus précisément par le site Sp1-like localisé en position -25. Cette régulation s’effectue, au moins en partie, par l’intermédiaire de Sp3, lequel est induit par l’IL-1ß à travers un mécanisme dépendant de NFkB.
Ces données mettent en lumière le processus de régulation de l’expression du TßRII par l’IL-1ß. La compréhension des bases moléculaires mise en jeu dans la réduction de l’expression du TßRII par l’IL-1ß permettent de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’arthrose et faciliteront l’identification de nouvelles approches thérapeutiques.

Détermination et différenciation sexuelles chez les poissons "le cas des esturgeons" - SPACne et "opeintre" devient "proteine"

L’esturgeon, de la famille des Acipenséridés, est un poisson ancestral, commercialement très intéressant et menacé d’extinction. Déjà élevé depuis plusieurs années pour la réintroduction dans le milieu et la production de caviar, des questions demeurent quant à son système de détermination du sexe. Nous avons entrepris d’en explorer la voie génétique, d’une part en recherchant le polymorphisme moléculaire par des approches de criblages aléatoires, d’autre part en étudiant l’expression du génome par une technique de criblage différentiel.

SPACNE a été développé en réponse à des évolutions devant être opérées sur le logiciel SPAC créé précédemment. Une protéine peut désormais, grâce à son poids moléculaire et à sa composition en acides aminés, être identifiée parmi les données d’une banque protéique ou nucléique par le biais d’une requête plus complète et avec des résultats plus pertinents.

Etude structurale du complexe entre la protéine SBP2 et l'ARN SECIS, deux partenaires cruciaux pour la synthèse des sélénoprotéines chez les eucaryotes

Longtemps considéré comme toxique, le sélénium est aujourd'hui reconnu comme essentiel.
Il est impliqué dans un grand nombre de maladies telles que certaines myopathies, le cancer ou l'infertilité masculine mais son mode d'action est mal défini. Admise comme le 21ème acide aminé, la sélénocystéine (acide aminé U ou Sec) représente la forme biologique majeure du sélénium et constitue une exception à la règle universelle du code génétique. En effet, le codon spécifique de la Sec est le codon UGA, habituellement lu comme signal de terminaison de la traduction. Les sélénoprotéines ainsi produites sont des enzymes impliqués majoritairement dans des processus d'oxydo-réduction et de défense contre les radicaux libres.
La première partie de ce travail de thèse a porté sur l'étude de deux partenaires de l'incorporation atypique de la sélénocystéine dans les protéines. Chez les eucaryotes, la protéine SBP2 et l'ARN SECIS (fragment de l'ARNm situé dans la région 3' non traduite) font partie d'une machinerie complexe permettant la reprogrammation du codon UGA Sec. En vue de la cristallisation de ce complexe, diférentes constructions de la protéine et de l'ARN ont été utilisées.
Des protocoles d'expression et de purification permettant d'obtenir les macromolécules dans des quantités raisonnables ont été mis au point. Malgré le criblage de plusieurs milliers de conditions, il n'a pas été possible d'obtenir de cristaux de complexe ou de la protéine seule. La caractérisation biophysique de la protéine SBP2 par diffusion de lumière, ultracentrifugation analytique et RMN a révélé une absence de structuration. Dans les mécanismes moléculaires permettant la synthèse des sélénoprotéines, le complexe SBP2/ARN SECIS agit comme une plateforme pour le recrutement d'autres facteurs qui pourraient être nécessaires à la stabilisation de la protéine SBP2. Certains n'ont pas encore été identifiés.
La deuxième partie, complètement indépendante, a consisté à étudier les dommages causés par les rayons X sur un cristal et ses implications sur la résolution des structures cristallographiques.
Les modifications structurales engendrées peuvent parfois rendre le phasage et donc la résolution de la structure impossibles. Le suivi de ces dommages sur un cristal d'ARN bromé par l'enregistrement de spectres de fluorescence au cours d'une collecte de données cristallographiques a été le principal objectif de ce travail. Nous avons observé une modification systématique des spectres de fluorescence se corrélant bien avec la dose cumulée de rayons X provoquant la coupure de la liaison C-Br. Une conséquence pratique est que, par une simple diférence entre un spectre
quelconque et celui mesuré sur une solution de NaBr (100 % de brome libre), on obtient une excellente estimation du pourcentage de brome encore lié. Ces mesures supplémentaires pourraient permettre d'ajuster l'intensité du faisceau et d'évaluer l'occupation restante à tout moment au cours de la collecte, ce qui est nécessaire pour le phasage.

Mots-clés : sélénium, sélénoprotéine, ARN, structure, radiolyse, spectre de fluorescence

Nouvelles fonctions associées aux systèmes d'aminoacylation procaryotiques

Fonctions de la protéine Vif dans la réplication du Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1

Vif est un produit tardif de l’expression virale susceptible de jouer un rôle crucial lors de l’assemblage des particules virales. En effet, il a été montré qu’en absence de Vif, l’assemblage du VIH-1 aboutit à la production de particules virales non infectieuses présentant une morphologie aberrante et une instabilité du core, ainsi qu’un défaut de rétrotranscription de l’ARN génomique viral. La présence du facteur APOBEC-3G dans la cellule productrice est responsable de l’apparition de ces défauts, et Vif est capable de neutraliser l’effet antirétroviral d’APOBEC-3G. Les mécanismes impliqués dans l’inhibition du VIH-1 par APOBEC-3G ne sont pas complètement caractérisés et il est probable qu’une perturbation de l’assemblage soit responsable du phénotype observé en absence de Vif. Par ailleurs, Vif est associée à l’ARN viral dans les complexes cytoplasmiques d’assemblage du VIH-1 et est encapsidée en faibles quantités dans les particules virales.
Nous sommes partis de l’hypothèse que la fixation de Vif sur l’ARNv lui permet d’exercer un effet sur l’assemblage de la RNP virale soit dans le cytoplasme, soit dans les particules virales naissantes. Par une combinaison de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons montré que Vif fixe de manière spécifique et coopérative la région 5’ de l’ARN génomique et que des signaux régulateurs de l’assemblage et de la rétrotranscription sont impliqués dans le mécanisme de reconnaissance. Des sites primaires de fixation, à forte affinité pour Vif ont été caractérisés dans la région 5’ non traduite ainsi que dans l’ORF gag. La reconnaissance des sites secondaires de fixation nécessite de plus hautes concentrations de Vif.
Ces résultats nous ont poussé à étudier l’effet de Vif et des différents intermédiaires de maturation de la nucléocapside (NC) sur les étapes initiales de la rétrotranscription. En effet, Vif pourrait contrôler l’apparition des différentes NC en régulant la maturation de la particule ribonucléoprotéique virale. Nous avons montré que Vif peut influencer l’assemblage du complexe d’initiation de la rétrotranscription et l’efficacité de la rétrotranscription. L’ensemble de nos résultats suggère que Vif peut moduler l’activité des différentes NC sur les étapes initiales de la rétrotranscription du VIH-1.

Mots clés : rétrovirus – HIV – Vif – ARN – APOBEC – assemblage – maturation – nucléocapside - rétrotranscription.

Etude du rôle du sélénium et de la sélénoprotéine N dans les pathologies musculaires

Mots clés: sélénium, sélénoprotéines, sélénoprotéine N, dystrophies musculaires
congénitales, interactions protéine-protéine, modèles animaux, exploration fonctionnelle.
Longtemps considéré comme un composé toxique, le sélénium est maintenant
largement reconnu comme oligo-élément essentiel. Des carences alimentaires ont été
associées à de nombreuses pathologies.
La sélénocystéine est la forme biologique principale du sélénium. Cet acide aminé particulier
est spécifiquement incorporé dans les sélénoprotéines grâce à une machinerie traductionnelle
dédiée en réponse à un codon UGA, traditionnellement reconnu comme un codon stop.
A ce jour, la fonction moléculaire de la plupart des sélénoprotéines demeure inconnue. Parmi
celles-ci figure la sélénoprotéine N (SePN), une nouvelle protéine à sélénium identifiée en
1999 dans notre laboratoire par une approche bioinformatique.
En 2001, il a été démontré que des mutations dans le gène SEPN1 codant pour SePN étaient
responsables de différentes pathologies musculaires regroupées dorénavant sous le terme de
myopathies apparentées à la sélénoprotéine N.
Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur la fonction de SePN. Pour
comprendre son rôle, nous avons entrepris son étude selon différentes approches.
Dans un premier temps, j’ai contribué à montrer que SePN est une glycoprotéine de 65kDa,
associée aux membranes du réticulum endoplasmique. Ensuite, des approches biochimiques
successives ont permis de mettre en évidence son interaction avec différentes protéines de la
membrane, et dont l’identification est en cours.
Dans un deuxième temps, nous avons mis au point deux modèles animaux des pathologies
musculaires associées à un dysfonctionnement de SePN. Par une approche antisens, il a été
observé que l’inhibition de l’expression de SePN au cours du développement embryonnaire
chez le poisson zèbre entraînait une altération de l’organisation du tissu musculaire.
Parallèlement, tirant avantage du système Cre-Lox, nous avons obtenu des souris invalidées
pour SEPN1 dans tout l’organisme ou de façon tissu spécifique dans le muscle. De façon
surprenante, les animaux ainsi obtenus ne présentent pas de phénotype apparent, même si les
analyses histologiques préliminaires permettent d’observer un profil dystrophique classique
des fibres musculaires. En outre, les animaux semblent présenter une sensibilité accrue au
stress oxydatif induit. L’exploration fonctionnelle de ce modèle est poursuivie au laboratoire
et fait l’objet de plusieurs collaborations.
Enfin, une autre étude entreprise au cours de ma thèse concerne une mutation pathologique du
gène SEPN1 conduisant à l’apparition de myopathies chez l’homme. Par une approche
originale déduite du mécanisme atypique de traduction des sélénoprotéines, une stratégie qui
pourrait aboutir à terme à une thérapie génique pour certains patients a été mise au point.
L’ensemble de ces travaux va permettre d’augmenter nos connaissances sur le rôle de
la sélénoprotéine N dans le muscle ainsi que sur la fonction biologique de l’oligo-élément
sélénium dans ce tissu. Le but ultime de l’ensemble de ces travaux est de développer des
outils de diagnostic ainsi que des approches thérapeutiques ciblées.

Le facteur de transcription Staf : caractérisation et gènes cibles

Extraction des contraintes structurales à partir d'alignements de séquences d'ARN : matrices d'isostérie

Caractérisation fonctionnelle d’aptamères peptidiques dirigés contre la protéine anti-apoptotique Nr-13

Les cellules tumorales sont caractérisées par une dérégulation des processus de prolifération et d’apoptose. Les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 sont surexprimées dans de nombreux cancers chimiorésistants. L’inhibition de l’expression ou de l’activité de ces protéines devrait restaurer une sensibilisation des cellules tumorales aux agents chimiothérapeutiques. L’objectif de nos travaux de recherche a été de cibler la protéine Nr-13, membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, impliquée dans la transformation néoplasique induite par le virus du sarcome de Rous. A cette fin, nous avons tiré profit de la technologie des aptamères peptidiques, puissants outils moléculaires permettant d’inactiver spécifiquement une protéine cible. Après avoir isolé des aptamères peptidiques dirigés précisément contre Nr-13, nous avons évalué leur effet sur l’activité anti-apoptotique de leur cible dans plusieurs tests fonctionnels. Nous avons montré que ces aptamères peptidiques étaient capables d’inhiber efficacement l’activité de Nr-13 dans des tests de croissance en levure et en cellules de mammifères. De façon surprenante, l’un d’entre eux semble potentialiser l’activité de Nr-13 dans des extraits d’ovocytes de Xénope. Enfin, nous avons montré qu’un des ligands était capable d’inactiver totalement la protéine Nr-13 in vivo, dans le modèle du poisson zèbre. Nos résultats suggèrent que cibler un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2 à l’aide d’aptamères peptidiques représente une stratégie pertinente pour la conception de nouvelles molécules anti-tumorales.

La phosphorylation sur la tyrosine chez Escherichia coli K12 : caractérisation biochimiqueet rôle physiologique.

Structural and biophysical studies of RNase P and Aptamers

Le travail de cette thèse de doctorat fait partie d'un effort continu d'améliorer notre compréhension de la structure et de la stabilité de l'ARN: Dans la première partie, un aptamer d'ARN est étudié en complexe avec sa cible, le domaine Sec7 de la protéine intracellulaire cytohesin-1. Aptamers sont des molécules d'ARN sélectionnées in vitro qui ont une affinité rivalisant celle des anticorps monoclonaux, qui possèdent des propriétés pharmacologiques intéressantes et sont un outil puissant pour l'analyse fonctionnelle in vivo. Nous présentons également une recherche structurale systématique sur la façon dont les aptamers et leurs analogues naturelles se fixent sur leurs ligands afin de tracer des principes communs. Dans la deuxième partie, nous étudions le repliement de la RNase P prokaryotique induit par les counterions en utilisant la technique des fontes UV, avec comme but l'optimisation de la structure secondaire et tertiaire en vue de la cristallisation. Nous démontrons l'utilité de cette méthode tout d'abord dans deux cas d'exemple: Premièrement, des paramètres thermodynamiques sont extraits à partir du complexe dit de 'kissing', une interaction tertiaire typique présent dans de nombreux ARNs structurés. Ceci mène à la découverte que la dépendance de la temperature de fusion de la concentration ionique peut donner des indications sur la nature des transitions structurelles observées. Deuxièmement, nous étudions l'effet de mutations sur un ARN plus complexe, le site d'entrée du ribosome (IRES) du virus de l'hépatite C, et corrélons nos données de fonte UV avec un équilibre dynamique entre deux structures alternatives identifiées par empreinte chimique. Les leçons apprises de ces expériences sont alors appliquées à la RNase P pour perturber des interactions tertiaires spécifiques afin de faciliter la cristallisation. L'effet de ces mutations est étudié en utilisant la fonte UV et une nouvelle technique basée sur des oligonucléotides fluorescentes que nous développons. Finalement, des matrices de cristallisation pour la RNase P sont construits à partir de méthodes de plannification expérimentale, et une nouvelle approche pour la cristallisation en gels est développée.

Etudes fonctionnelles et structurales d'un transporteur membranire de multiples drogues et de 2 saccharose isomérases bactériennes

La protéine membranaire BmrA de Bacillus subtilis est un transporteur ABC (ATP-binding cassette) impliqué dans les phénomènes de résistance à de multiples drogues. Son protocole de purification a été optimisé afin de l'adapter aux exigences d'une étude cristallographique et une caractérisation détaillée du complexe protéine-détergent-lipides purifié a été réalisée par diverses méthodes biophysiques. Parallèlement, des essais de cristallisation ont été menés sur la protéine sauvage et sur un mutant inactif.
Les saccharose isomérases MutB de P. mesoacidophila MX-45 et SmuA de P. rubrum catalysent l'isomérisation du saccharose en isomaltulose et tréhalulose, deux édulcorants au fort potentiel nutritionnel et industriel. Les deux enzymes ont été cristallisées et de nombreuses structures de MutB native et de mutants, en complexe avec divers inhibiteurs ou avec le substrat naturel, ont été résolues nous permettant d'analyser les mécanismes et spécificités des réactions catalysées.

Etude de la maturation de l'extrémité 3' non traduite et de la traduction de l'ARN messager codant pour l'histone H4

Les recherches présentées dans ce mémoire ont porté sur l'expression des gènes d'histones de type réplication-dépendants. Ces gènes sont particuliers car leurs ARNm sont dépourvus d'introns et de queue poly A en 3', l'extrémité 3' étant générée par coupure endonucléolytique au cours d'un processus de maturation original impliquant plusieurs protéines et la snRNP U7.
Lors d'une première étude, nous avons étudié l'étape initiale de la réaction de maturation qui consiste en la fixation de la protéine HBP sur une structure de l'ARN pré-messager. À partir de mutants de HBP abolissant la fixation sur l'ARN nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart des mutations isolées se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine, en dehors du domaine central impliqué dans l'interaction avec l'ARN. Cette restauration s'effectuait sans perte de spécificité pour la séquence de fixation à l'ARN, suggérant que les domaines N- et C-terminaux sont impliqués dans le processus de reconnaissance de l'ARN.
Dans un second volet de notre étude portant sur la réaction de maturation de l'extrémité 3' de l'ARNm d'histone, nous avons examiné l'impact structural induit par la protéine HBP lors de sa fixation sur les extrémités 3' non traduites des ARNs pré-messagers des histones H4-12, H1t et H2a-614. En utilisant les techniques de sondage en solution nous avons montré que ces extrémités présentent de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès à la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation de l'ARN au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7. Enfin, nous avons pu montrer que ces changements de conformation étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7 à l'ARN pré-messager. Cependant, ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones puisque aucune modification importante n'a pu être détectée à l'extrémité 3' non traduite du gène d'histone H2a-614.
Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant que l'initiation de la traduction s'effectuerait par recrutement des ribosomes à l'intérieur de la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm entier, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée par l'hybridation de ses extrémités. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié un certain nombre de nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. L'ensemble des résultats obtenus lors des expériences de sondage en solution associés à ceux issus des études de traduction in vitro, de « toe print » et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original permettant d'expliquer la traduction atypique de l'ARNm H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de 2 sites d'entrée interne du ribosome ou « IRES ». Le premier ribosome serait recruté au niveau du codon d'initiation, le second près de la fin de la phase codante. Par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm, le deuxième ribosome pourrait être dirigé très efficacement sur le codon d'initiation. Cet enchaînement des deux ribosomes sur la phase codante permettrait d'expliquer d'une part, la grande efficacité de traduction observée dans le cas de notre modèle H4-12 et d'autre part, le rôle accessoire des séquences non traduites

Mots clés : protéine HBP humaine, ARNm de l'histone H4, triple hybride, sélections génétiques, structure en solution, maturation en 3', snRNP U7, traduction in vitro, IRES, relations structure-fonction.

Fonction de l'ARNIII de Staphylococcus aureus dans la régulation de l'expression des gènes de virulence : identification des cibles par une approche protéomique

Fonction de l’ARNIII dans le contrôle de l’expression des gènes de virulence de Staphylococcus aureus : analyse des cibles par une approche protéomique

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène provoquant plusieurs types d’infections chez l’homme et les animaux. Sa pathogénie est liée à la synthèse de nombreux facteurs de virulence dont des toxines, des protéases et des adhésines. L’expression de ces protéines est régulée au cours de la croissance bactérienne par un ARN régulateur, l’ARNIII. Pendant la transition vers la phase stationnaire, cet AN inhibe la synthèse de plusieurs protéines de paroi (adhésines) et active l’expression des protéines sécrétées (toxines, enzymes). L’ARNIII régule l’expression des gènes au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel par des mécanismes encore peu élucidés. Pour rechercher d’autres gènes dont l’expression est contrôlée par l’ARNIII, nous avons utilisé une approche protéomique. La comparaison des profils de protéines d’une souche sauvage et d’une souche isogénique délétée del’ARNIII a montré que l’ARN est impliqué dans la régulation de la synthèse non seulement des facteurs de virulence, mais aussi des protéines impliquées dans le métabolisme et dans la réponse au stress. Dans les bactéries, la protéine Hfq est souvent requise pour assister les ARN régulateurs dans leur fonction. Nous avons comparé le profil des protéines de la souche délétée de Hfq avec le profil de la souche n’exprimant pas d’ARNIII. Cette analyse a mis en évidence plusieurs protéines dont l’expression est dépendante à la fois de l’ARNIII et de Hfq, suggérant que Hfq pourrait agir comme un co-facteur de l’ARNIII. Des évidences expérimentales suggèrent que l’ARNIII est constitué de plusieurs domaines régulateurs. Ainsi le domaine 3’est suffisant pour la régulation de l’expression du gène spa. L’analyse du profil protéique de la souche mutante transformée avec ce domaine a montré que le domaine 3‘ est un domaine régulateur multifonctionnel, capable de réguler la synthèse de plusieurs protéines impliquées dans la virulence et le métabolisme cellulaire.


Mots clés : Régulation post-transcriptionelle, virulence, ARN régulateur, protéomique, Staphylococcus aureus



Function of Staphylococcus aureus RNAIII in the regulation of virulence gene expression : target analysis by proteomic approach

Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium causing a wide spectrum of infections in humans and animals. Pathogenesis of S. aureus relies on the synthesis of several virulence factors, including secreted toxins, proteases and adhesins. A regulatory RNA, RNAIII, tightly regulates virulence factor expression during bacterial growth. During the transition into stationary phase, this RNA inhibits the synthesis of several cell wall proteins (adhesions) and activates the expression of secreted proteins (toxins, enzymes). RNAIII regulates gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels, but the mechanisms of this regulation remain poorly understood.
In order to find other genes regulated by RNAIII, we used proteomic approach. Comparison between protein profiles of the wild-type strain and the isogenic strain, which does not express RNAIIII, enabled us to show that RNAIII is implicated nor only in the regulation of virulence factors synthesis, but also in the regulation of expression of several proteins involved in metabolism and stress response. In many bacteria, Hfq protein is often necessary to assist regulatory RNA in their functioning. We compared protein profiles from the strain deleted of Hfq with the profile from the strain that does not express RNAIII. This analysis evidenced several proteins which expression is dependent at the same time of RNAIII and Hfq. These data suggest that Hfq might act as a cofactor of RNAIII. Several experiments suggest that RNAIII is formed of several regulatory domains. For example, 3’ domain is sufficient for the regulation of expression of the spa gene. We analyzed protein profiles from the strain transformed with this domain. We demonstrated that the 3’ domain is a multifunctional regulatory domain, which is able to regulate the synthesis of several proteins implicated in the virulence and in the cellular metabolism.


Key-words : Post-transcriptional regulation, virulence, regulatory RNA, proteom

Etude comparative de couples ANRt/aminoacyl-ARNt synthétases chez la levure et la mitochondrie humaine

My work has focused on the specific recognition of transfer RNAs (tRNAs) by aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs), an obligate prerequisite for translation fidelity. I have taken advantage of molecular biology strategies, based on in vitro transcribed tRNAs and cloned enzymes, to explore the structure/function relationships of yeast and human mitochondrial (mt) aminoacylation systems using large mutagenic analyses. Structural and functional aspects were further tackled by crystallization assays and in vivo approaches, respectively.
So far, it was believed that recognition and aminoacylation rules of isoacceptor tRNAs from a given organism are identical. Investigation of the family of arginine isoaccepting tRNAs in yeast and its peculiar relationship with tRNAAsp lead me to the following discoveries: (i) isoacceptors are aminoacylated with different efficiencies (~20 fold range) and are protected from mischarging by idiosyncratic antideterminants, (ii) isoacceptor tRNA4Arg is a remnant aspartate acceptor since only two point mutations were sufficient to convert its specificity - this is a direct example of genesis of molecular diversity from a common ancestor. Aminoacylation systems of mammalian mitochondria remain under-explored despite their tRNAs, coded by mt genome, are structurally "bizarre" and involved in severe disorders. Our efforts lead to the assignment of 10 missing nuclear genes coding for human mt aaRSs, which turned out to be encoded by a different set of genes than the one for cytosolic aaRSs. Detailed analysis of the aspartylation system, chosen as a model mt system, revealed (i) less stringent identity of a mt tRNA than of classical tRNAs, (ii) a subtle and focused adaptation of the bacterial-type nuclear-encoded mt AspRS. This illustrates co-evolutionary processes of the human mt and nuclear genomes. Further, I have uncovered the signals hindering a mt tRNAAsp to be a substrate for a non-mt aaRS. Strikingly, it is not the global structural degeneracy of the tRNA which hinders the most cross-aminoacylation, but a single base-pair in the D-stem.

Key words: aminoacylation, tRNA, aminoacyl-tRNA synthetase, tRNA identity elements, human mitochondrial systems, isoacceptors, evolution.

ARN régulateurs procaryotiques et virulence

ARN REGULATEURS PROCARYOTIQUES ET VIRULENCE

Durant ma thèse, je me suis intéressé à deux ARN régulateurs procaryotiques. Le premier, l’ARNIII, est un ARN multifonctionnel qui régule l’expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Le second, CopA, est un ARN strictement complémentaire à sa cible et régule le taux de réplication du plasmide R1. L’ARNIII réprime l’expression des facteurs d’adhésion et active la synthèse des toxines en fin de phase exponentielle de croissance. Nous avons montré que le domaine 3’ de l’ARNIII est nécessaire et suffisant pour l’inhibition de l’expression de deux protéines au niveau post-transcriptionnel, la protéine A et SA1000. La fixation de l’ARNIII à ses cibles est initiée par un contact boucle-boucle qui est rapidement converti en un duplex étendu. Ce duplex est ensuite la cible de la RNase III pour induire la dégradation rapide de l’ARNm. Nous avons également montré que la protéine Hfq est un ligand de l’ARNIII. Cette protéine est généralement impliquée dans des mécanismes de régulation basés sur des ARN régulateurs. La fonction de cette interaction dans la virulence de S. aureus est en cours d’étude.
L’ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. La fixation de CopA à sa cible, l’ARNm repA, inhibe la traduction et favorise la dégradation de l’ARNm par la RNase III. L’interaction entre les deux ARN conduit à la formation d’un complexe irréversible. Ce complexe n’est pas un duplex étendu, mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire, l’hélice C. Nous avons montré que les structures des deux ARN ont évoluées afin de bloquer la progression du complexe irréversible vers le duplex étendu. De plus, nous avons montré que au sein du complexe irréversible, l’hélice C est reconnue efficacement par la RNase III au niveau de sites préférentiels.

PROCARYOTIC REGULATORY RNA AND VIRULENCE

During my thesis, I was interested by two procaryotic regulatory RNA. The first, RNAIII, is a multifunctionnal RNA which regulates the expression of virulence gene in Staphylococcus aureus. The second, CopA, is stricly complementary to its target and regulates the rate of plasmid R1 replication. RNAIII inhibits the expression of adhesins and activates the synthesis of toxins at the end of exponential growth phase. We have shown that the 3’ end domain of RNAIII is necessary and sufficient for the inhibition of the expression of two proteins at the post-transcriptional level, the protein A and SA1000. The binding of RNAIII to its targets is initiated by a loop-loop interaction which is rapidly converted to a full duplex. This duplex is the target of RNase III to induce the rapid degradation of the mRNA. We have also shown that Hfq protein is a ligand of RNAIII and the function of this interaction in the virulence of S. aureus is under investigation.
The antisense RNA CopA regulates bacterial plasmid R1 replication by controlling the rate of synthesis of the RepA initiator protein. The binding of CopA to its target, repA mRNA, inhibits the synthesis of RepA and promotes the degradation of the mRNA. The interaction between the two RNA leds to the formation of an irreversible complex. This complex is not a full duplex but contains a four-way junction stabilized by a long intermolecular helix, helix C. We have shown that the structures of both RNA have evolved to block the progression from the irreversible complex to the full duplex. Moreover, we have shown that in the irreversible complex, helix C is recognized by RNase III at preferentials sites.

MOTS-CLES : ARN régulateurs, relation structure-fonction des ARN, Staphylococcus aureus, réplication plasmidique

Lysyl-Oxydases : Rôle dans la Peau Humaine, la Peau Reconstruite et le Cancer

Study of a new class of HIV-1 reverse transcriptase and integrase inhibitors

L’Organisation Mondiale de la Santé estime que le VIH-1 est porté par 40 millions de personnes à travers le monde, et qu’il a causé 3,1 millions de décès et 4,9 millions de nouvelles infections au cours de l’année 2004. Les traitements actuels ciblent principalement la rétrotranscriptase du VIH-1 (RT), qui catalyse le passage de l’ARN viral génomique en ADN double brin, substrat de l’intégrase virale (IN). Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en thérapie sont soit des terminateurs de chaîne analogues de nucléosides (NRTIs), soit des inhibiteurs non-nucléosidiques (NNRTIs) qui se fixent au niveau d’une poche hydrophobe, à proximité du site de fixation des nucléotides.
Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs de la RT, nous nous sommes intéressés aux 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT), qui inhibent l’inositol monophosphatase humaine par chélation de deux ions Mg2+ catalytiques distants de 3,7Å. Or les sites catalytiques polymérase et RNase H de la RT contiennent respectivement deux ions Mg2+ distants de 3,57 et 4Å. En outre, l’IN du VIH-1 possède une plate-forme catalytique proche de celle du site RNase H. Nous avons ainsi entrepris d’étudier l’effet des 3,7-DHT sur les activités de la RT et de l’IN du VIH-1.
Nous avons observé une inhibition spécifique de l’une ou l’autre activité de la RT par certaines 3,7-DHT. Des études enzymatiques ont ensuite montré que l’inhibition de l’activité ADN polymérase est non-compétitive vis-à-vis des nucléotides, à l’instar des NNRTIs. Néanmoins, l’étude de RT résistante ou dépourvue du site de fixation des NNRTIs permet d’exclure un mode d’action identique à cette classe d’inhibiteurs. Des expériences de gel-filtration, permettant de suivre l’état d’oligomérisation de la forme active de la RT, hétérodimérique, montrent que les 3,7-DHT ne sont pas capables de la dissocier. L’inhibition des activités de la RT par liaison des 3,7-DHT aux acides nucléiques a été écartée, entre autres, par des expériences de fluorescence. Enfin nous avons montré que les 3,7-DHT n’inhibent pas la polymérisation lors de l’étape de translocation.
En revanche, une forte baisse de l’inhibition de la synthèse d’ADN a été mise en évidence lorsque la concentration en Mg2+ diminue, ce qui suggère que les 3,7-DHT ne lient le site actif polymérase qu’en présence des ions Mg2+. L’implication des cations catalytiques dans les mécanismes d’inhibition par les 3,7-DHT a également été étayée par l’observation d’une inhibition des activités de « processing » et de transfert de l’IN, dépendante du cation utilisé.
Malheureusement, des cultures cellulaires en présence de 3,7-DHT ont révélé une cytotoxicité importante. Ce résultat était partiellement prévisible, compte tenu de l’existence de nombreuses enzymes bimétalliques cellulaires et de l’utilisation de 3,7-DHT de première génération. Dans l’objectif d’améliorer ces composés, sur la base de leur relation structure/activité, nous avions également pour projet d’obtenir la structure cristallographique d’un complexe ternaire RT/(matrice/amorce)/dNTP, en présence d’une 3,7-DHT. Des cristaux de différents complexes ont été obtenus, mais n’ont pas permis d’obtenir de clichés de diffraction aux rayons X et restent par conséquent à améliorer.
Nous avons également étudié l’influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT du VIH-1.
En résumé, les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse permettent d’élaborer les prémices d’une stratégie de conception « rationalisée » d’inhibiteurs de la RT et de l’IN, dans l’objectif d’obtenir des composés plus spécifiques et plus affins de l’un ou l’autre site catalytique.

Développements Méthodologiques pour l'Analyse Structurale et Dynamique de Protéines par Résonance Magnétique Nucléaire du Solide.

La détermination de la structure et de la dynamique moléculaire dans les protéines sont deux étapes essentielles vers la compréhension de la relation entre structure et activité de ces biomolécules. L'introduction d'échantillons micro-cristallins de protéine, et des améliorations récentes dans la résolution et la sensibilité des expériences multi-dimensionnelles de RMN du solide, font de cette spectroscopie un outil puissant pour sonder la structure et la dynamique de protéines en phase solide. Dans ce contexte, nous avons utilisé un échantillon microcristallin, uniformément marqué de la protéine Crh dimérique comme modèle pour le développement méthodologique d’expériences de RMN de protéines en phase solide. Nous avons montré que Crh microcristalline existe sous la même forme dimérique que dans les cristaux étudiés par radiocristallographie. Nous avons également montré comment l’utilisation de séquences de découplage hétéronucléaire expérimentalement optimisées, de type CM (Cosine Modulated), peuvent apporter une amélioration spectaculaire de la sensibilité en RMN du solide de protéines. Nous avons aussi étudié la sélectivité et l’efficacité de séquences de transfert d’aimantation 13C-15N par les couplages scalaires dans la protéine Crh. Par ailleurs, nous avons développé une méthode de mesure des vitesse de relaxation longitudinale (R1) des azotes-15 et avons mis en évidence une forte corrélation entre les vitesses de relaxation mesurées et une représentation simple mais cohérente de la mobilité interne de la protéine Crh. Nous avons également étudié l’influence de la deutération de Crh sur la mesure des vitesses de relaxation spin-réseau 15N. De plus, nous présentons le développement d’un modèle théorique initialement proposé par Torchia et Szabo, afin d’interpréter qualitativement les fluctuations dans la dynamique locale, et distinguer entre l’influence respective de la vitesse et de l’amplitude du mouvement, dans le cadre d’un modèle dynamique de diffusion dans un cône. Enfin, nous décrivons l’influence du phénomène de diffusion de spin dans les expériences de RMN sous MAS dans le cas d’expériences 13C-13C et 15N-15N, sur la protéine Crh microcristalline, et nous proposons un modèle semi-empirique de diffusion de spin entre paires 15N-15N pour décrire le comportement initial des courbes de relaxation mesurées sur Crh.

Functional and structural features of the regulation of a eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetase: the case of Saccharomyces cerevisiae aspartyl-tRNA synthetase

Accurate translation of genetic information necessitates the tuned expression of a large group of genes. Amongst them, controlled expression of the enzymes catalyzing the aminoacylation of tRNAs, the aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS), is essential to insure translational fidelity. Here, it is shown that expression of AspRS is regulated in Saccharomyces cerevisiae by a feedback mechanism, that necessitates the binding of AspRS to its messenger RNA. The correlation between AspRS expression and mRNAAspRS and tRNAAsp concentrations, as well as the presence of AspRS in the nucleus, suggest an original regulation mechanism. It is proposed that the surplus of AspRS, not sequestered by tRNAAsp, is imported in the nucleus where it binds to mRNAAspRS and thus inhibits its accumulation.
We have established the folding of the 300-nucleotides long 5’ end of mRNAApRS and identified the structural signals involved in the regulation process. We propose that the mRNAAspRS fragment folds in two independent and symmetrically structured domains spaced by two single-stranded connectors. Domain I displays a tRNAAsp anticodon-like stem-loop structure that is restricted in domain II to a short double-stranded helix. The overall mRNA structure, based on enzymatic and chemical probing, support a model where each monomer of yeast AspRS binds one individual domain and recognizes the mRNA structure like it recognizes its cognate tRNAAsp.
Finally, the consequences of an increased concentration of AspRS in the cell have been tested. In vitro, high AspRS concentrations lead to mis-aspartylation of tRNAAsn and tRNAGlu. In vivo, the design of a reporter gene conferring an antibiotic resistance, dependent on mischarged tRNAs, did not allow to detect any cross aminoacylation. However, the proteomic analysis of yeasts overexpressing AspRS pointed out the conditions of AspRS accumulation in the cell by detecting the presence of an additional control mechanism at the post-translational level.

Optimisation de la production de cartillage in vitro pour des études pharmacologiques de molécules anti-artrosiques

Etude comportementale de la lysyl oxydase (LOX) et de la lysyl oxydase-like (LOXL) au cours de l'élastogenèse - implication de leur pro-région.

Etudes fonctionnelles et structurales de la protéine EED, partenaire cellulaire du virus VIH-1 et de la cellulase « froide » Cel5G de Pseudoalteromonas haloplanktis

La protéine humaine EED appartient à la famille des «Polycomb». Elle intervient dans la régulation génique. Elle jouerait aussi un rôle dans le cycle du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) en participant au transport du complexe de préintégration et en facilitant la réaction d’intégration. EED a été surproduite afin d’être cristallisée seule et en complexe avec les protéines virales IN, MA et Nef. Un modèle de EED a été construit par homologie structurale. D’après nos expériences de « phage display », les régions susceptibles d’interagir avec les partenaires viraux se situent sur des boucles de ce modèle. La bactérie psychrophile P. haloplanktis produit la cellulase Cel5G. Les structures de cette cellulase seule et en complexe avec le cellobiose, ont été déterminées à haute résolution par remplacement moléculaire. La cellulase Cel5A de la bactérie mésophile E. chrysanthemi a été utilisée comme modèle. Nos résultats permettent de mieux comprendre les déterminants structuraux responsables de l’adaptation des enzymes aux basses températures.

Caractérisation des changements de conformation chez bmrA, un transporteur ABC de multiples drogues chez Bacillus subtilis: exploitation des modèles structuraux

Nous avons récemment caractérisé un nouveau membre de la superfamille des transporteurs ABC, BmrA, issu de Bacillus subtilis, qui est capable de transporter activement différentes drogues en utilisant l’énergie produite par l’hydrolyse de l’ATP. Nous avons entrepris une étude structurale par transfert d’énergie de résonance sur le transporteur reconstitué en protéoliposomes et ainsi pu démontrer que, dans la membrane, BmrA se trouve sous forme homo-dimérique, et adopte majoritairement une conformation fermée, compatible avec les structures où l’ATP se fixe à l’interface des deux domaines de fixation des nucléotides. Grâce à des modèles moléculaires de BmrA, et par une approche de pontage covalent de cystéines néo-introduites, nous avons montré que la première boucle intracellulaire est une zone charnière qui joue vraisemblablement un rôle essentiel dans la transduction de l’énergie qui se propage du site de fixation de l’ATP vers les zones membranaires de fixation des drogues.

NMR studies of structure, dynamics and interactions of biomolecules

Phosphorylation des protéines au niveau de la tyrosine chez Staphylococcus aureus : mécanisme moléculaire et role biologique.

Les collagènes dans le développement des vertébrés : Utilisation du poisson zèbre.

Rôle des collagènes XV et XVIII au cours du développement. Etude préliminaire chez le poisson zèbre (Danio rerio)

Les collagènes sont des protéines multimodulaires dont la fonction principale est de maintenir la cohésion des tissus et des organes. Depuis les dernières années, un nombre croissant de données mettent en évidence la multifonctionnalité de ces molécules qui ont un rôle actif dans le comportement cellulaire. Les collagènes XV et XVIII possèdent des domaines respectifs restine et endostatine qui ont des propriétés anti-angiogéniques et anti-tumorales et dont la fonction reste encore inconnue. Aussi, l’objectif de cette thèse a été d’obtenir les outils et les concepts nécessaires afin de débuter l’étude fonctionnelle de ces collagènes et de leurs domaines respectifs, dans le modèle de développement du poisson zèbre dont les caractéristiques rendent les études plus aisées par rapport aux autres vertébrés.
Ainsi, une seule forme de alpha1(XV) a été identifiée et l’étude de l'expression spatio-temporelle de col15a1, par hybridation in situ, a montré une expression restreinte à la notochorde. Trois isoformes du collagène XVIII, qui diffèrent par leur séquence N-terminale (courte, intermédiaire et longue), ont été isolées : elles présentent les caractéristiques conservées de leurs orthologues. Le collagène XVIII montre des singularités d'expression spatio-temporelle comparé à ses orthologues vertébrés. Les études par RT-PCR et hybridation in situ, avec une sonde C-terminale commune aux trois isoformes, ont permis d’observer son expression, dès le stade 5 somites, dans la plaque neurale antérieure, dans les cellules adaxiales. Pendant la période de segmentation, il est localisé dans l'épiderme, le rein et le cerveau. A 30 hpf, un gradient d'expression de col18a1 apparaît le long de la notochorde et du tube neural. L'expression spatio-temporelle différentielle des trois isoformes a été réalisée afin d'étudier l'expression précise de chacune d'elles (qui s'est avérée différente) et ainsi compléter l'étude globale réalisée avec la partie commune du collagène XVIII. Les résultats suggèrent que le collagène XVIII joue certainement un rôle important dans l'organogenèse de différents organes comme la peau, le cerveau et le rein. Aucune expression n'a été déterminée dans les cellules endothéliales. L’étude de la fonction par surexpression du NC1 et de l'endostatine ainsi que l’invalidation du gène de collagène XVIII utilisant les morpholinos a débuté. Les résultats préliminaires suggèrent que COL18A1 est particulièrement requis au développement précoce du cerveau. La fonction exacte reste, cependant, à être élucidée.

Modulation de l’activité de la protéine anti-apoptotique Nr13 par des aptamères peptidiques et caractérisation de son homologue humain Nrh.

On observe dans de nombreux cancers une perturbation d’un mécanisme fondamental du contrôle de l’homéostasie cellulaire : l’apoptose. Cette forme de mort cellulaire est finement contrôlée par la famille des protéines Bcl-2. Dans de nombreux cancers, des protéines anti-apoptotiques sont surexprimées, empêchant les cellules de mourir et conférant une résistance à la chimiothérapie. La protéine anti-apoptotique aviaire Nr13 surexprimée dans des cellules infectées par le virus du sarcome de Rous est potentiellement impliquée dans la tumorigenèse. Nous avons mis au point un modèle basé sur l’inhibition de Nr13 qui permettrait d’empêcher la progression tumorale en utilisant la stratégie des aptamères peptidiques. Par ailleurs, nous avons caractérisé Nrh, orthologue humain de Nr13 en recherchant des partenaires de la protéine et nous avons analysé son rôle dans la tumorigenèse.

Identification d’un gène impliqué dans la chondrogenèse et le développement précoce

Le cartilage est principalement composé de collagène de type II sécrété par les chondrocytes. Nous avons montré que l’épissage alternatif de son gène Col2a1 était régulé de manière opposée par la BMP-2 et le TGF-1 dans des chondrocytes embryonnaires de souris cultivés sur plastique. Par ailleurs, le traitement de chondrocytes à la BMP-2 nous a conduit à identifier un gène par RT-PCR différentielle, Bat (BMP-2 activated transcript), dont l’expression est stimulée par ce facteur de croissance. L’expression de ce gène favorise le phénotype des chondrocytes en culture, mais bloque leur hypertrophie. En outre, nous avons montré que la protéine Bat, très conservée au cours de l’évolution, joue un rôle dans la mise en place de l’axe dorso-ventral au cours du développement embryonnaire chez le poisson-zèbre, Danio rerio. Ce travail aura mis en évidence deux implications de la protéine Bat : dans la chondrogenèse et dans le développement précoce.

Caractérisation de deux homologues de la protéine de survie Nr-13

Caractérisation biochimique de la protéine de capside du virus de l'hépatite C, étude de domaine d'interaction avec les gouttelettes lipidiques et mise en évidence de formes alternatives

Rôle du cholestérol et de la cavéoline-1 sur la structure, l'activité et la fonction de la Glycoprotéine-P responsable du phénotype de multi-chimiorésistance des cancers.

Le phénotype de multi-chimio-résistance typique des cancers est principalement dû à la surproduction de protéines membranaires de la famille des transporteurs ABC telles que la Glycoprotéine-P (Pgp). En utilisant un modèle de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë humaine CEM exprimant divers degrés de chimiorésistance, nous avons montré que la Pgp se localise préférentiellement dans des domaines membranaires enrichis en cholestérol. Dans ce modèle, les quantités de cavéoline-1 et de cholestérol cellulaires sont corrélées au niveau de chimiorésistance. De plus, le cholestérol membranaire contrôle l'activité ATPasique de la Pgp et l'efflux de médicaments et sa déplétion partielle entraîne la chimio-sensibilisation des cellules CEM résistantes. Une étude par microscopie électronique de la Pgp révèle une structure dimérique. L'existence de dimères de Pgp dans la membrane plasmique des cellules CEM résistantes a pu être corroborée par électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une analyse par spectrométrie de masse. De façon intéressante, les dimères de Pgp ont été détectés dans les zones enrichies en cholestérol.
Nous démontrons ici l'importance des membranes enrichies en cholestérol à la fois sur la structure et sur la fonction de la Pgp.

Mécanisme d'hydrolyse de l'ATP et de transport de drogues par BmrA, homologue bactérien de la glycoprotéine-P.

Elément invMED1 et complexe LRP130 d'activation du gène MDR1 humain : découverte et application à la génothérapie du phénotype de multi-chimiorésistance des cancers.

Le phénotype de résistance des cancers à la chimiothérapie (MDR) est principalement dû à la surproduction de protéines membranaires telles que la Pgp codée par le gène MDR1 chez l'humain. Nous rapportons ici la découverte d'un élément cis-activateur de la transcription des gènes MDR1 et MVP impliqués dans le phénotype MDR, que nous avons nommé invMED1. Nous avons étudié un facteur nucléaire de 150 kDa dont l'intensité d'interaction avec l'élément invMED1 croît lorsque le niveau de chimiorésistance intrinsèque de cellules cancéreuses en culture augmente. La caractérisation de ce facteur a permis d'identifier sa composante protéique, la protéine LRP130, et suggère la présence d'un partenaire ARN. Ces résultats permettent de développer nos stratégies de génothérapie du phénotype MDR. Grâce à l'établissement de lignées cancéreuses issues de mélanomes uvéaux humains et caractérisées par un phénotype MDR complexe, nous avons pu tester le bénéfice apporté par l'administration de leurres transcriptionnels reproduisant l'élément invMED1 sur des cellules qui co-expriment les gènes MDR1 et MVP. Ces travaux permettent d'espérer une thérapie génique du phénotype MDR qui aboutisse au traitement des cancers résistants par la chimiothérapie conventionnelle.

Calix-[n]-arène Solfonates: Propriétés Complexantes et Anti-coagulants

ATPases et GTPases bactériennes : transporteurs de multiples drogues et protéines orphelines.

Contribution à l'étude de la phosphorylation des protéines chez trois espèces bactériennes

Etude du transporteur MRP1 humain responsable de la résistance de cellules cancéreuses à la chimiothérapie et recherche d'inhibiteurs spécifiques.

Un outil bioinformatique de détection de similarités structuralers dans les structures 3D de protéines.

SuMo est un système bioinformatique de comparaison de structures 3D de protéines. Le but de cette approche est de faciliter l'exploration des données structurales par les biologistes et la formulation d'hypothèses fines sur l'implication biologique des protéines.

Contrairement aux approches existantes dans ce domaine, SuMo ne s'attache pas à résoudre un problème formel dérivant d'une modélisation de la notion de fonction biologique. Ceci autorise des efforts constants de développement de l'heuristique mise en oeuvre, permettant de se rapprocher des notions intuitives de fonction biologique plutôt que de coller à un modèle mathématique peu réaliste.

L'heuristique développée est basée sur la représentation des macromolécules par des groupements chimiques aux propriétés géométriques hétérogènes et associés en triplets.

L'utilisation de SuMo s'effectue directement à partir du serveur web sumo-pbil.ibcp.fr. Le criblage de la banque de sites de fixation de ligands générée par et pour SuMo permet de repérer de façon conviviale de potentielles cibles thérapeutiques.

Analyse statistique des structures tridimensionnelles des protéines et validation de familles structurales à bas taux d’identité

Etude des voies de l’endocytose chez l’organisme modèle Dictyostelium discoideum : caractérisation structurale et fonctionnelle du complexe AP-1

Transformation cellulaire par l'oncogéne v-src et caractérisation des orthologues de la protéine de survie Nr-13

Le collagène de typeI de Danio rerio:isolement, carctérisation et rôle au cours du développement

Etude cristallographique et fonctionnelle des isoenzymes de l'alpha amylase d'orge: leurs structures 3D en action révèlent des modes distincts dereconnaissances des polysaccahrides et de nouvelles molécules inhibitrices.

Interactions cellules-matrice extracellulaire et réparation tissulaire

Détermination de la structure 3D de la catalase

Rôle du colagène de type V dans l'élaboration d'une matrice extracellaulire. Approche in vitro par production de la molécuale recombinante et in vivo par transgénèes chez la souris

Caractérisation d'YvcC transporteur ABC de Bacillus subtilis impliqué dans le transpoort de multiples drogues et notamment d'antibiotiques

Production de collagène dans les plantes transgéniques. Caractérisation moléculaires, propriétés biologiques et amélioration du collagène recombinant produit en vue de son application en tant que biomatériaux

HCVDB: Unbe base de données de séquences du virus de l'hépatite C interconnectée au webiciel NPS@ d'outils bioinformatiques d'analyse de séquences et de structures

Etude des manteaux vésiculaires impliqués dans le transport en docytique chez l'amibe Dictyostelium discoideum: fonction pléiotrope du complexe AP-1

Modulation de phénotype typique de multichimiorésistance (MDR) des cellules cancéreuses humaines par des leurres transcriptionnels et étude de la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 au niveau de la région MED-1

Le phénotype de multichimiorésistance MDR est une cause majeure de l'échec de la chimiothérapie anticancéreuse. Le phénotype dit typique s'explique entre autres par la surexpression de protéines membranaires parmi lesquelles la plus importante est la glycoprotéine-P (P-gp) codée par le gène MDR1 chez l'homme. La modulation du phénotype MDR est une priorité majeure du traitement clinique anticancéreux. Dans cette optique, nous développons au laboratoire des stratégies innovantes et efficaces pour moduler le phénotype MDR en agissant non pas sur la protéine elle-même mais sur son gène. Ces approches sont basées sur l'utilisation de leurres transcriptionnels (destinés à dévier la fixation de protéines régulatrices sur ces leurres plutôt que sur leur région régulatrice) et de ribozymes (petits ARN capables de cliver l'ARN messager du gène MDR1) pour réduire l'expression de la P-gp. Les résultats positifs de modulation obtenus avec les leurres transcriptionnels sur les modèles cellulaires construits au laboratoire ont été transposés avec succès à des cellules tumorales MDR in vitro et seront testées prochainement sur des cellules in situ. L'issue de ces tests permettra d'envisager sérieusement l'usage de ces approches pour le traitement clinique des cancers. De plus, afin de mieux comprendre la régulation de la transcription du gène MDR1, nous avons isolé et identifié une protéine qui interagit spécifiquement avec une région régulatrice spécifique du gène MDR1, appelée MED-1. Le rôle de cette région consisterait à initier correctement la transcription du gène. Nous avons identifié cette protéine par spectrométrie de masse MALDI-TOF comme étant la protéine LRP130. Nous avons également entrepris l'étude du rôle de cette région MED-1 sur la transcription du gène MDR1 humain. Ces approches sont destinées à améliorer la sensibilité des cancers MDR à la chimiothérapie conventionnelle et à mieux comprendre la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 humain.

Régulation transcriptionnelle de Nr-13 par l'oncoprotéine v-src

Contribution à l'étude de la phosphorylation des protéines bactériennes au niveau de la tyrosine:proposition d'un rôle biologique

Bioinformatique structurale des protéines

Effet du TGF beta sur les interactions entre les kératinocytes et la laminine5 :implication potentielle au cours d ela cicatrisation tissulaire

Contribution à l'étude de l'élongationau cours de la synthèse protéique chez les mamifères:Interaction entre le facteur EF-2 et les protéines P0, P1 et P2 du ribosome. Fixation de l'ATP sur EF-2. Phosphorylation de P2 par la GRK2.

Mécanisme des transporteurs ABC conférant la résistance pléiotropique aux drogues:comparaison des sytèmes de maimfères et de levure

Caractérisation et fonctions des domaines moléculaires de l'aminopropeptide d'un collagène fibrillaire d'oursin

crédits | copyright 2006 © SFBBM